基因克隆的基本原理

基因克隆是一种在分子水平上对目的基因进行操作的技术，是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，它常用于研究基因功能和生物学特性。

基因克隆的基本原理和流程

基因克隆的基本原理

基因克隆的基本原理是利用 DNA的复制和转录过程，将目的基因插入到载体中，再通过转化、转导或转录等过程，将目的基因大量复制，从而进行深入研究。在基因克隆过程中，目的基因的获取是关键步骤，通常采用PCR、DNA文库筛选、人工合成等方法。载体是基因克隆的另一个重要组成部分，常见的载体包括质粒、噬菌体、病毒等。

基因克隆的流程

首先，确定目标基因的序列。准确的基因序列是基因克隆的起点，可以通过DNA测序实现。测序得到的序列需要反复核对和验证，确保无误。

其次，使用靶向PCR技术放大目标基因。PCR是一种体外DNA分子生物学的重要技术，可以快速复制目标基因的特定片段。选择合适的引物并优化反应条件，使PCR成功扩增出目标片段。

第三，进行切割和连接反应。通过限制性内切酶的选择和切割，剪切出PCR扩增得到的DNA条段，并在适当的条件下将其与质粒或病毒载体进行连接。可以使用PCR产物作为目标基因，或通过合成DNA序列获得目标基因。

接着，将目标基因载入宿主细胞。常见的载体是质粒和病毒载体，这些都可以带有抗生素或荧光标记，以便于在细胞中进行筛选和表达。

最后，进行筛选和表达。将载体注入细胞中，包括离体转染和细胞共培养。如果基因表达成功，目标蛋白会被细胞表达并积累。从细胞或培养物中提取蛋白，使用分子生物学技术定量和鉴定，确定是否达到表达预期。

基因克隆的方式

（1）RACE技术

基本原理：根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5‘端的方法称为5‘RACE，用于扩增3‘端的称为3’RACE。

用途：是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法。

（2）应用cDNA差示分析法克隆基因

基本原理：该法充分发挥了PCR技术以指数形式扩增双链DNA模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。因为试验对象和供试探针在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群，保证绝大部分遗传信息能被扩增。每次T减D反应后仅设置72℃复性与延伸，94℃复性这两个参数共20个PCR循环，PCR产物的特异性和所得探针的纯度非常高。

用途：对染色体步移技术、定位克隆技术、cDNA差显技术等方法的补充。

（3）Gateway大规模克隆技术

基本原理：利用入噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，通过整合与切出反应，实现基因快速克隆和载体间平行转移。

用途：为大规模克隆基因组注释的可译框架提供了保障。

（4）基因的图位克隆

基本原理：首先，通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。其次通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。然后，根据基因功能互作原理鉴定目的基因。

用途：分离未知性状的目的基因。

基因克隆技术的应用

1. 基因改良作物的培育

基因克隆技术可以通过将特定基因导入植物细胞中，使植物获得特定的性状，如抗虫、抗病、耐旱等。这种技术可以大大提高作物的产量和质量，减少农药的使用，降低对环境的污染。

2. 动物的基因改良

基因克隆技术可以用于改良家畜的基因，使其具有更好的生产性能。例如，通过导入生长激素基因，可以使猪、牛等家畜生长更快，提高肉类的产量和质量。此外，基因克隆技术还可以用于改良家禽的基因，使其对疾病更加抵抗力强。

3. 基因治疗

基因治疗是将一些外源基因导入到患者相应的受体细胞当中，使得外源基因表达的产物可以治疗患者的某种疾病，例如恶性肿瘤、白血病、心脑血管疾病和糖尿病等等，起到了传统药物难以达到的医疗效果，对医学技术的进步做出了重要的贡献。